Research Progress in Mechanisms of NLRP3 Inflam-masome Activation and Regulation
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摘要:
炎症小体是一种由Nod样受体(NLR)家族成员与PYHIN (pyrin and HIN domain)家族成员组成的胞浆多蛋白复合物，能被多种病原相关分子模式或损伤相关分子模式激活。炎症小体的功能是激活半胱天冬酶1(Caspase-1)，进而引起促炎细胞因子白细胞介素(IL)-1β和IL-18的成熟和分泌，并诱导细胞焦亡。NLR家族蛋白3(NLRP3)炎症小体是由NLRP3、接头蛋白ASC和效应蛋白Caspase-1组成的大分子多蛋白复合体。与其他炎症小体不同，NLRP3炎症小体可以被多种刺激物活化，包括微生物组分和内源性分子。NLRP3炎症小体在免疫系统和人类疾病中的重要性显而易见，但其激活及调节的机制仍不清楚。在此，主要对NLRP3炎症小体活化和调节的机制进行综述。
Abstract:Members of nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat (LRR) -containing (NLR) family and the pyrin and HIN domain (PYHIN) family can form cytoplasmic multiprotein complexes termed "inflammasomes", which can be activated by diverse pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) or damage-associated molecular patterns (DAMPs).The function of inflammasomes is to activate Caspase-1, which leads to the maturation and secretion of pro-inflammatory cytokines interleukin 1 beta (IL-1β) and IL-18 and induces pyroptosis, a form of cell death.The NLR family pyrin domain-containing 3 (NLRP3) inflammasome is a multiprotein complex consisted of NLRP3, ASC and Caspase-1.Unlike other inflammasomes, the NLRP3 inflammasome can be activated by diverse stimuli, including bacterial products and endogenous molecules.The importance of the NLRP3 inflammasome in immunity and human diseases has been well documented, but the mechanisms of its activation and regulation remain unclear.In this review we summarized current understanding of the mechanisms of NLRP3 inflammasome activation and regulation.
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Keywords:
- NLRP3 inflammasome /
- activation /
- K+ efflux /
- Ca2+ signaling /
- ROS /
- lysosome
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炎症小体是一种胞浆多蛋白复合物，主要介导宿主对微生物感染和细胞损伤的免疫反应。炎症小体的聚集引起半胱天冬酶原(pro-Caspase-1)蛋白裂解，生成活化的半胱天冬酶1(Caspase-1)，Caspase-1又促使细胞因子前体白细胞介素1β前体(pro-interleukin-1 beta, pro-IL-1β)和白细胞介素18前体(pro-interleukin-18, pro-IL-18)转变为成熟的IL-1β和IL-18。在很多免疫反应中，成熟的IL-1β是有效的促炎介质，能将先天性免疫细胞招募至感染部位，并调节获得性免疫细胞，而成熟的IL-18能够促进干扰素γ(interferon γ，IFN-γ)的生成，增强自然杀伤细胞和T细胞的杀伤活性。活化的Caspase-1能诱导促炎形式的细胞死亡，即细胞焦亡。炎症小体的组成包括模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)、凋亡相关斑点样蛋白[apoptosis-associated speck-like protein containing a Caspase-recruitment domain(CARD)，ASC]以及半胱氨酸蛋白酶Caspase-1[1]。
参与病原体识别的PRRs主要有4种：Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)、Nod样受体(Nod-like receptors，NLRs)、RIG-I样受体(RIG-I-like receptors，RLRs)和C型凝集素受体(C-type lectin receptors)。这些PRRs能够识别保守的微生物结构单元或病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)，如细菌细胞壁的成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)或肽聚糖；也能识别细胞或组织损伤产生的损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)，如腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)。TLRs通常定位于细胞外表面和内体上，而NLRs定位于胞浆，识别进入细胞内环境的PAMPs和DAMPs [2]。迄今为止，已发现5种能够形成炎症小体的PRRs[NLR家族蛋白(NLRP1)、NLRP3、NLRC4、Pyrin和AIM2]。
NLRP3炎症小体活化引起的促炎细胞因子IL-1β和IL-18的分泌，以及细胞焦亡是机体的一种自我保护措施，可帮助抵抗外源性的微生物感染和内源性的细胞损伤，维持自身内环境稳态。同时，NLRP3炎症小体也参与糖尿病、动脉粥样硬化、痛风等多种疾病的发生发展，使临床病症和治疗更加复杂[3]。本文通过介绍NLRP3炎症小体激活和调节机制的研究进展，不仅有助于了解炎症的病理生理过程，而且有助于为NLRP3炎症小体相关的疾病治疗提供理论依据，为新药开发提供作用靶标参考。
1. NLRP3炎症小体
在所有的炎症小体中，NLRP3炎症小体与痛风、2型糖尿病、阿尔茨海默病等多种疾病密切相关[3]。NLRP3炎症小体是由NLRP3、接头蛋白ASC和效应蛋白Caspase-1组成的一种相对分子质量约为700 000的大分子多蛋白复合体。
1.1 核心蛋白NLRP3
NLRP3属于NLRs蛋白家族，该家族包含22个人源蛋白和至少34个鼠源蛋白。大多数NLRs的结构由3个部分组成：氨基端Caspase招募区(CARD)、热蛋白结构域(pyrin domain，PYD)、酸性反式激活域或BIR结构域(baculovirus inhibitor of apoptosis protein repeat domain，BIR)，主要介导下游蛋白间相互作用；中间的核苷酸结合和寡聚化结构域(nucleotide-binding oligomerization domain，NACHT，包括NAIP、CIITA、HET-E和TP1蛋白)，主要介导自身寡聚化；碳端的亮氨酸重复序列(leucine-rich repeats，LRRs)，主要参与识别刺激。正常生理条件下，NLRP3的NACHT结构域与LRRs结合，使其处于自我抑制状态。当出现PAMPs或DAMPs时，NLRP3解除自我抑制状态，暴露NACHT结构域，发生寡聚化，NLRP3氨基端的PYD结构域招募含有PYD的ASC接头蛋白，ASC的CARD结构域招募含有CARD的pro-Caspase-1，完成炎症小体的组装(见图 1)。
1.2 接头蛋白ASC
ASC是相对分子质量约为22 000的接头蛋白，由PYD和CARD组成。ASC主要分布于人单核/巨噬细胞核，应激时迅速转移至胞浆，连接NLRP3和pro-Caspase-1，促进NLRP3炎症小体的激活。
1.3 效应蛋白Caspase-1
Caspase-1又称为IL-1β转化酶，是NLRP3炎症小体的效应蛋白。由前体分子pro-Caspase-1自身裂解，形成有活性的Caspase-1，即p20和p10这2个亚单位，促进pro-IL-1β和pro-IL-18剪切为成熟的IL-1β和IL-18。
2. NLRP3炎症小体的活化
大多数微生物刺激，如TLRs的配体，并不能直接激活NLRP3炎症小体，而是为其激活做准备工作。而在ATP、成孔毒素或颗粒物质诱导NLRP3激活之前，需要微生物刺激或细胞因子对巨噬细胞进行预处理。因此，巨噬细胞中NLRP3炎症小体的激活需要2步反应：第1步(启动)是微生物或内源性的分子促进核因子(nuclear factor-κB, NF-κB)入核，调控NLRP3和pro-IL-1β转录表达；第2步(激活)由ATP、成孔毒素、病毒RNA或颗粒物质引起，通过多种细胞和分子效应，促进炎症小体组装，介导pro-IL-1β剪切成熟(见图 2)。
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图 2 NLRP3炎症小体的双信号激活模型LPS：lipopolysaccharide，脂多糖；IL-1R：interleukin-1 receptor，白细胞介素1受体；TNF：tumor necrosis factor，肿瘤坏死因子；TNFR：tumor necrosis factor receptor，肿瘤坏死因子受体；Caspase-8：半胱天冬酶8；FADD：FAS-associated death domain protein，FAS相关死亡结构域蛋白；BRCC3：63位赖氨酸特异的去泛素酶BRCC36；TRIM31：tripartite motif 31，三结构域蛋白31；Ub：ubiquitin，泛素；CASR：calcium-sensing receptor，钙敏感受体；GPRC6A：G protein-coupled receptor, family C, group 6, subtype A，G蛋白偶联受体C家族6组成员A；PLC：phospholipase C，磷脂酶C；IP3：1, 4, 5-trisphosphate，1, 4, 5-三磷酸肌醇；ER：endoplasmic reticulum，内质网；ROS：reactive oxygen species，活性氧簇；P2X7R：purinergic receptor，嘌呤能受体。Figure 2. A two-signal model for NLRP3 inflammasome activation2.1 NLRP3炎症小体的启动
当用NLRP3的激动剂直接刺激巨噬细胞(如小鼠的髓系巨噬细胞)时，NLRP3炎症小体不激活或仅有少量激活，然而用细菌配体预处理后，NLRP3炎症小体的激活会明显增强，该预处理的过程称之为启动步骤，为NLRP3炎症小体的激活提供第一信号。与ASC和Caspase-1不同，休眠期的巨噬细胞中NLRP3蛋白表达较低，不足以激活炎症小体。启动阶段，细菌组分如TLR的配体，或内源性分子如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)和IL-1β，通过激活NF-κB，诱导NLRP3蛋白的表达。近来研究发现，FAS相关死亡结构域蛋白(FAS-associated death domain protein, FADD)和Caspase-8也能调节启动阶段NLRP3的表达[4-5]。在缺乏启动步骤时，通过逆转录病毒使巨噬细胞高表达NLRP3，再给予激动剂刺激，也能够增强炎症小体的激活[6]。因此，启动阶段通过诱导NLRP3蛋白的表达，可促进炎症小体的激活。
NLRP3蛋白表达是炎症小体激活的限速步骤。研究发现，启动后的巨噬细胞在短时间内(10 min)，无法诱导NLRP3蛋白的表达，却显著增强了炎症小体的激活[6-7]。由此可见，启动阶段对炎症小体激活的调节作用不仅仅依赖于转录调控，也依赖于转录后修饰。通过对NF-κB通路信号分子缺陷的小鼠巨噬细胞进行研究发现，髓样分化因子(myeloid differentiation factor 88，MyD88)、下游的激酶如IL-1受体相关激酶1(IL-1 receptor-associated kinase 1，IRAK1)和IRAK4与NLRP3激活的转录调节有关，而β干扰素TIR(Toll/IL-1 receptor)结构域衔接蛋白(TIR-domain-containing adaptor inducing interferon-beta，TRIF)和IRAK1在启动阶段的转录后修饰中起到了重要作用[8-9]。此外，泛素化过程也参与调节NLRP3的转录后修饰。在启动阶段，E3泛素连接酶TRIM31碳端的卷曲螺旋结构与NLRP3的PYD结构域结合，促使NLRP3蛋白发生K48连接的多聚泛素化及蛋白酶体降解，从而抑制NLRP3炎症小体的激活[10]。而BRCC3，以及包含JAMM域的Zn2+金属蛋白酶可促进NLRP3的去泛素化，并诱导NLRP3的激活[11-12]。泛素化过程涉及的蛋白酶种类较多，相关的泛素酶对NLRP3炎症小体激活的作用各异，因此泛素化过程对NLRP3激活的作用十分复杂，虽然近来针对泛素化修饰的研究渐多，但其对于NLRP3炎症小体激活的确切作用仍未有定论。简而言之，多种泛素酶综合调节NLRP3炎症小体的激活，共同维持内环境的稳态。
2.2 NLRP3炎症小体的激活
鉴于NLRP3激动剂化学结构的多样性，NLRP3与其激动剂之间不大可能是物理性相互作用，NLRP3可能是通过感受其激动剂诱导的细胞内信号而活化的。近来，该信号机制引起了广泛的争论。一些分子和细胞效应被认为是NLRP3炎症小体激活的触发剂，包括K+外流、Ca2+信号、ROS、线粒体功能失调和溶酶体破裂。
2.2.1 K+外流对NLRP3炎症小体激活的作用
早期报道提出，在LPS刺激的小鼠巨噬细胞中，K+载体如尼日利亚菌素，能引起IL-1β的成熟和分泌[13]。随后的研究也证实了K+外流在NLRP3炎症小体激活过程中的重要性：高浓度的细胞外K+能抑制NLRP3炎症小体的激活，但不影响AIM2(absent in melanoma 2)和NLRC4(NLR-family CARD-containing protein 4)等炎症小体的激活；大多数NLRP3的激动剂都能引起K+外流，包括ATP、尼日利亚菌素和颗粒物质，降低细胞内K+浓度就足以激活NLRP3炎症小体[14]。另有研究显示，低浓度的K+也可以在无细胞的体系中引起NLRP3炎症小体的聚集[15]。因此，相关研究显示细胞内K+浓度的降低被认为是NLRP3炎症小体激活的共同机制[14]。
然而，细胞内K+浓度的降低与NLRP3活化的关联性仍未研究清楚。在没有K+外流的情况下，NLRP3激活突变(NLRP3R258W)的巨噬细胞中，NLRP3炎症小体能够正常活化，且不被细胞外高浓度的K+影响[14]。这表明，细胞内K+浓度的降低可能造成NLRP3构象的改变，且这种改变与NLRP3激活突变引起的构象改变一致。NLRP3通过感受细胞内K+浓度降低的信号，改变自身构象，发生寡聚化，完成炎症小体的组装，促进pro-Caspase-1蛋白裂解，IL-1β和IL-18分泌，以及细胞焦亡，但是，该设想还未得到公认，NLRP3构象改变的具体位点和形式，细胞内K+浓度降低对NLRP3活化的其他影响，以及K+浓度降低引起NLRP3激活的阈值，这些疑问在深入探究K+外流与NLRP3活化的关联时，不可忽略。
2.2.2 Ca2+信号与NLRP3炎症小体激活
研究发现，Ca2+螯合剂1，2-二(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N'，N'-四乙酸四乙酰氧甲基酯(BAPTA-AM)能抑制IL-1β的分泌，因而推测Ca2+信号可能参与了NLRP3炎症小体的激活[16]。ATP、尼日利亚菌素和颗粒物质等刺激物在激活NLRP3炎症小体的过程中，都能引起钙调动。研究显示，抑制Ca2+信号可以阻断NLRP3炎症小体的激活，但不影响AIM2和NLRC4等炎症小体的激活；内质网(endoplasmic reticulum, ER)作为细胞内的主要钙库，对Ca2+信号参与NLRP3炎症小体激活的过程有重要作用，敲除或药理抑制内质网上的Ca2+释放通道，即1，4，5-三磷酸肌醇受体(1，4，5-trisphosphate receptor，IP3R)，可以抑制钙调动和NLRP3的激活；磷脂酶C(phospholipase C，PLC)通过介导二磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate, PIP2)的裂解，生成1，4，5-三磷酸肌醇(1，4，5-trisphosphate，IP3)，进而激活IP3R，使内质网释放Ca2+，促进NLRP3的激活[17]。另有研究显示，钙敏感受体(calcium-sensing receptor，CASR)是一种G蛋白偶联受体，在PLC的上游发挥作用，可引起钙调动和NLRP3的激活，但CASR和相关的家族成员GPRC6A，只在细胞外Ca2+诱导的NLRP3激活中发挥作用，对ATP诱导的NLRP3的激活无影响[18]。值得注意的是，Ca2+调动和线粒体钙超载可能引起线粒体功能紊乱，进而促进NLRP3的激活，在细胞外介质培养基中加入Ca2+，会引起颗粒物质的形成和K+外流，使这些实验结果复杂化[14]。
近来亦有研究提出，NLRP3炎症小体的激活与Ca2+信号无关；该研究将胞浆K+浓度的降低和胞浆Ca2+浓度的升高对NLRP3激活的作用进行比较发现，Ca2+对NLRP3的激活不是必要的，因而认为BAPTA阻断NLRP3的激活，与它抑制Ca2+信号的作用无关[19]。
综上所述，NLRP3炎症小体的激活本就是多种细胞和分子效应综合协调的结果，影响因素众多，过程十分复杂，任意一种离子浓度变化都可能影响其激活过程，除了K+和Ca2+浓度变化对NLRP3的激活有影响外，氯离子通道蛋白CLIC1和CLIC4也可能参与调节NLRP3炎症小体的激活。
2.2.3 线粒体功能失调和ROS
目前，线粒体和ROS在NLRP3炎症小体激活过程中的确切作用尚未明确[20-21]。还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶生成的胞浆ROS是NLRP3炎症小体激活的常见信号。硫氧还蛋白互作蛋白(thioredoxin-interacting protein, TXNIP)是NLRP3的配体，且对ROS敏感。在正常生理条件下，氧化还原酶硫氧还蛋白(thioredoxin，TRX)与TXNIP结合，并抑制其活性；当细胞内ROS浓度增加时，该复合物解离，TXNIP与NLRP3(主要是LRRs结构域)结合，进而激活NLRP3(见图 3)。然而，缺乏NADPH氧化酶活性的人外周血单核细胞和小鼠巨噬细胞中，NLRP3炎症小体仍然能够正常激活[22]。这可能是由于ROS的来源除NADPH氧化酶外，还有线粒体和黄嘌呤氧化酶。农药百草枯发挥细胞毒性作用，主要是通过促进ROS生成，上调TXNIP的表达，诱导NLRP3炎症小体激活和细胞因子分泌，进而引起细胞焦亡；而水飞蓟素可以诱导TRX和抗氧化酶的表达，抑制TXNIP和NLRP3的结合，进而降低百草枯的细胞毒性[23]。
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图 3 NLRP3炎症小体的胞浆ROS激活模型Figure 3. The cytoplasmic ROS model of NLRP3 inflammasome activation早期研究发现，线粒体的扰动能促进NLRP3炎症小体的激活，推测线粒体功能紊乱与NLRP3激活有关[24]。定位于线粒体的保守的NLR家族蛋白NLRX1，能够促进线粒体ROS的生成；同时，释放至胞浆的氧化的线粒体DNA能与NLRP3相互作用并激活NLRP3。双磷脂酰甘油是一种通常位于线粒体内膜的特异性磷脂，它可以转运到外膜，进而与NLRP3的LRRs结合，并激活NLRP3 [25]。线粒体相关调节蛋白[mitochondria-associated adaptor，即线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial anti-viral signaling protein，MAVS)]也与NLRP3炎症小体的激活有关，但具体作用机制仍存在争议[4, 26]。研究表明，MAVS能与NLRP3相互作用，且在可溶性刺激物(如ATP、尼日利亚菌素)诱导NLRP3激活时是必需的，在颗粒物质[如单钠尿酸盐(monosodiumurate，MSU)、明矾]刺激时是非必需的[26]。另有研究显示，MAVS在RNA病毒诱导的NLRP3激活中发挥作用，在非病毒刺激(如ATP、尼日利亚菌素)诱导时，不发挥作用[4, 27]。总而言之，线粒体在NLRP3炎症小体激活过程中的确切作用仍不清楚。
2.2.4 溶酶体破裂导致组织蛋白酶B释放
溶酶体是在真核细胞中分解蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的一种细胞器，内含蛋白酶、核酸酶、磷酸酶、脂肪酶等多种水解酶。溶酶体既能分解外界进入细胞内的物质，也能消化内源性的大分子。组织蛋白酶B是木瓜蛋白酶家族的一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶，颗粒物质通过内吞作用，可破坏溶酶体膜，使组织蛋白酶B释放至胞浆，从而激活NLRP3炎症小体。CA-074-Me是组织蛋白酶B的化学抑制剂，该化合物能抑制NLRP3的激活；然而，对于组织蛋白酶B缺陷的巨噬细胞，颗粒物质依然能够诱导NLRP3炎症小体的激活[28]。因此，组织蛋白酶B的抑制剂对NLRP3炎症小体激活的抑制作用可能是因为脱靶效应或组织蛋白酶家族成员冗余。近来研究认为，多种组织蛋白酶能够促进NLRP3的启动和激活，且这些蛋白酶都能被CA-074-Me抑制[29]。
颗粒物质除了引起胞浆组织蛋白酶的释放，也引起K+外流，此过程依赖于吞噬作用，是NLRP3炎症小体激活的必需步骤；将巨噬细胞与亲溶酶体剂二肽L-亮氨酸-亮氨酸甲基酯共同孵育，能引起K+的迅速外流，加速NLRP3的激活[14]。此外，通过吞噬作用进入胞浆的颗粒物质，在被溶酶体完全清除前，也能引起胞浆ROS的上调，经ROS/TXNIP/NLRP3信号通路，诱导NLRP3炎症小体激活[30]。
综上所述，K+外流、Ca2+信号、胞浆ROS、溶酶体破裂等分子和细胞效应相互渗透，相互影响，综合调节了NLRP3炎症小体的激活。
3. NLRP3炎症小体激活的调节因子
已被报道的NLRP3炎症小体激活的调节因子，包括双链RNA依赖的蛋白激酶(double-stranded RNA dependent protein kinase，PKR)、鸟苷酸结合蛋白5(guanylate-binding protein 5，GBP5)和Nek7[31-33]。
3.1 蛋白激酶PKR
PKR调节所有已知的炎症小体的激活，包括NLRP1、NLRP3、NLRC4和AIM2。有研究分别从野生型和PKR缺陷型的小鼠中提取巨噬细胞进行体外实验发现，与野生型相比，PKR缺陷型的小鼠提取的巨噬细胞中，Caspase-1的激活、IL-1β和IL-18的分泌明显受到抑制；用PKR的抑制剂2-氨基嘌呤(2-aminopurin，2-AP)处理野生型小鼠来源的巨噬细胞后，Caspase-1的激活和IL-1β的分泌降低；因此，该研究认为基因敲除或药理抑制PKR之后，相关刺激所引起的Caspase-1的激活，以及IL-1β和IL-18的成熟均会有所减弱[34]。然而，也有研究认为，给予NLRP3的激动剂如ATP、尼日利亚菌素和二氧化硅时，PKR+/-来源和PKR-/-来源的巨噬细胞内，Caspase-1的活化以及IL-1β和IL-18的分泌水平与未给予时无显著变化；野生型来源的巨噬细胞内，Caspase-1的活化以及IL-1β和IL-18的分泌水平与PKR-/-来源的巨噬细胞相当，因而该研究认为PKR对炎症小体的激活、Caspase-1的活化、pro-IL-1β的裂解以及IL-1β的分泌不是必需的[35]。
3.2 鸟苷酸结合蛋白GBP5
与PKR相似，GBP5在NLRP3炎症小体激活过程中的作用也存在争议。在GBP5缺陷型小鼠来源的巨噬细胞中，细菌组分如LPS和尼日利亚菌素诱导的Caspase-1的活性减弱；而颗粒物质如MSU或明矾诱导的组织蛋白酶B正常释放，Caspase-1的激活以及IL-1β的分泌不受影响，即在ATP、尼日利亚菌素和细菌刺激时，GBP5会促进NLRP3炎症小体的激活；在不溶性颗粒物质刺激时，GBP5对NLRP3炎症小体的激活无影响[36]。另有研究则认为，在GBP5缺陷的小鼠巨噬细胞中，经典的和非经典的炎症小体激活通路均不受影响，即NLRP3炎症小体可以正常激活[37]。
3.3 Nek7
与PKR和GBP5不同，有3项独立的研究均认为Nek7在NLRP3炎症小体激活过程中有重要作用[31-33]。Nek7属于NIMA(never-in-mitosis A)相关激酶家族，主要参与调节有丝分裂过程和DNA损伤反应。研究显示，有Nek7缺陷的小鼠胚胎发育晚期会死亡且生长受到阻滞，表明Nek7在胚胎生长和存活过程中有着举足轻重的作用[38]。相关研究认为，所有NLRP3的刺激物(包括ATP、尼日利亚菌素、MSU结晶和明矾)诱导的NLRP3炎症小体的激活均需要Nek7，而NLRC4和AIM2等炎症小体的激活不需要Nek7 [31-33]。Nek7的催化区和NLRP3的LRRs区可相互作用，形成NLRP3-Nek7大分子复合物，NLRP3的激动剂能增强该作用，Nek7介导的NLRP3的激活与其激酶活性无关[31-32]。Nek7在K+外流的下游可调控NLRP3的寡聚化、ASC斑点的形成和Caspase-1的激活[31]。Nek7对NLRP3激活的重要作用在体内模型中进一步得到证实：与野生型小鼠相比，Nek7缺陷的小鼠IL-1β分泌减少，免疫细胞的聚集减弱，疾病严重度降低[31-32]。这些结果均表明，Nek7是NLRP3炎症小体激活的正向调节因子。当细胞外有高浓度的K+存在时，Nek7和NLRP3的相互作用被抑制，表明此相互作用需要K+的外流，考虑可能是因为细胞内K+浓度的降低引起NLRP3构象的改变，从而促进Nek7与NLRP3结合；当NLRP3发生不依赖于K+外流的激活突变(NLRP3R258W)时，炎症小体的激活仍然需要Nek7 [31]。因此，探究Nek7对NLRP3激动剂的反应机制，将会给NLRP3炎症小体激活的分子机制研究提供新的思路。
4. NLRP3炎症小体与疾病
在微生物感染过程中，NLRP3炎症小体可帮助宿主免疫系统抵抗甲型流感病毒、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌等感染性的微生物，维持机体内环境稳态。然而，NLRP3炎症小体的异常激活也会引发某些遗传性或获得性炎症疾病，如痛风、2型糖尿病、动脉粥样硬化、炎症性肠病和阿尔茨海默病等[3]。
痛风是一种因尿酸盐浓度升高，造成MSU结晶沉积而引起的慢性关节炎。MSU结晶作用于宿主巨噬细胞，可激活NLRP3炎症小体，释放成熟的IL-1β，加重痛风发作[39]。2型糖尿病是以胰岛素抵抗和胰岛B细胞功能失调为特征的慢性疾病，常伴随胰岛淀粉样多肽(islet amyloid polypeptide，IAPP)的沉积。IAPP刺激树突细胞和巨噬细胞，调控NLRP3炎症小体激活，诱导pro-Caspase-1蛋白裂解和IL-1β分泌，促进2型糖尿病的发生发展。动脉粥样硬化发生在大动脉内壁，以脂质代谢障碍为病变基础，常进展为心肌梗死或卒中[40]。低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)可激活NF-κB信号通路，上调巨噬细胞中pro-IL-1β的表达，同时诱导ROS生成和溶酶体破裂，并促进胆固醇结晶的沉积，进一步激活NLRP3炎症小体。炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是一种因免疫反应失调所致的反复发作的肠道慢性炎症性疾病，包括克罗恩病和溃疡性结肠炎，临床表现为腹痛、腹泻和直肠出血，易进展为结直肠癌。NLRP3参与炎症性肠病的机制比较复杂，一方面NLRP3抑制肠道有害微生物的过度繁殖，另一方面某些细菌产物可激活NLRP3炎症小体，引起IL-1β过度分泌，增加炎症性肠病的易感性[41]。阿尔茨海默病是一种神经退行性疾病，临床表现为进行性记忆减退和认知功能障碍[42]。小胶质细胞吞噬β淀粉样蛋白，可引起溶酶体破裂，激活NLRP3炎症小体，生成IL-1β，IL-1β通过诱导tau蛋白高度磷酸化，影响突触可塑性，抑制长时程增强效应和学习记忆能力，而NLRP3炎症小体可进一步抑制小胶质细胞对β淀粉样蛋白和细胞碎片的清除能力，从而加重阿尔茨海默病病情。
综上所述，NLRP3炎症小体参与上述疾病的发生过程，因而成为这些疾病的潜在治疗靶标。靶向NLRP3炎症小体及其下游信号分子的药物，主要包括一线降糖药格列本脲、IL-1受体拮抗剂阿那白滞素、IL-1β单克隆抗体卡纳单抗、β-羟基丁酸[43]和磺酰脲类化合物MCC950[44]，但这些药物存在半衰期短、生物利用度差、不易透过血脑脊液屏障等缺点，因此NLRP3抑制剂在相关疾病治疗中的应用仍需进一步的临床研究。
5. 结语
近年来，对NLRP3炎症小体的研究取得了重要进步，证实了K+外流对NLRP3炎症小体激活的重要性，但Ca2+信号，线粒体功能失调和ROS，以及溶酶体破裂对NLRP3激活的具体作用仍存在争议。进一步探究多种细胞和分子效应综合调节NLRP3炎症小体激活和共同维持内环境稳态的机制，将为相关疾病的诊断和治疗提供新的方向和思路。
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图 2 NLRP3炎症小体的双信号激活模型
LPS：lipopolysaccharide，脂多糖；IL-1R：interleukin-1 receptor，白细胞介素1受体；TNF：tumor necrosis factor，肿瘤坏死因子；TNFR：tumor necrosis factor receptor，肿瘤坏死因子受体；Caspase-8：半胱天冬酶8；FADD：FAS-associated death domain protein，FAS相关死亡结构域蛋白；BRCC3：63位赖氨酸特异的去泛素酶BRCC36；TRIM31：tripartite motif 31，三结构域蛋白31；Ub：ubiquitin，泛素；CASR：calcium-sensing receptor，钙敏感受体；GPRC6A：G protein-coupled receptor, family C, group 6, subtype A，G蛋白偶联受体C家族6组成员A；PLC：phospholipase C，磷脂酶C；IP3：1, 4, 5-trisphosphate，1, 4, 5-三磷酸肌醇；ER：endoplasmic reticulum，内质网；ROS：reactive oxygen species，活性氧簇；P2X7R：purinergic receptor，嘌呤能受体。
Figure 2. A two-signal model for NLRP3 inflammasome activation
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[1] Bae J Y, Lee S W, Shin Y H, et al.P2X7 receptor and NLRP3 inflam-masome activation in head and neck cancer [J].Oncotarget, 2017, 8(30): 48972-48982. http://cn.bing.com/academic/profile?id=957b0c7952306cd52dfd52904a9f9fd5&encoded=0&v=paper_preview&mkt=zh-cn
[2] Chen G Y, Núñez G.Inflammasomes in intestinal inflammation and cancer [J].Gastroenterology, 2011, 141(6): 1986-1999. doi: 10.1053/j.gastro.2011.10.002
[3] Baldwin A G, Brough D, Freeman S.Inhibiting the inflammasome: a chemical perspective [J].J Med Chem, 2016, 59(5): 1691-1710. doi: 10.1021/acs.jmedchem.5b01091
[4] Allam R, Lawlor K E, Yu E C, et al.Mitochondrial apoptosis is dispensable for NLRP3 inflammasome activation but non-apoptotic Caspase-8 is required for inflammasome priming [J].EMBO Rep, 2014, 15(9): 982-990. doi: 10.15252/embr.201438463
[5] Gurung P, Anand P K, Malireddi R K S, et al.FADD and caspase-8 mediate priming and activation of the canonical and non-canonical Nlrp3 inflammasomes [J].J Immunol, 2014, 192(4): 1835-1846. doi: 10.4049/jimmunol.1302839
[6] Schroder K, Sagulenko V, Zamoshnikova A, et al.Acute lipo-polysaccharide priming boosts inflammasome activation independently of inflammasome sensor induction [J].Immunobiology, 2012, 217(12): 1325-1329. doi: 10.1016/j.imbio.2012.07.020
[7] Juliana C, Fernandesalnemri T, Kang S, et al.Non-transcriptional priming and deubiquitination regulate NLRP3 inflammasome activation [J].J Biol Chem, 2012, 287(43): 36617-36622. doi: 10.1074/jbc.M112.407130
[8] Fernandesalnemri T, Kang S, Anderson C, et al.Cutting edge: TLR signaling licenses IRAK1 for rapid activation of the NLRP3 inflammasome [J].J Immunol, 2013, 191(8): 3995-3999. doi: 10.4049/jimmunol.1301681
[9] Lin K M, Hu W, Troutman T D, et al.IRAK-1 bypasses priming and directly links TLRs to rapid NLRP3 inflammasome activation [J].Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 111(2): 775-780. doi: 10.1073/pnas.1320294111
[10] Song H, Liu B, Huai W, et al.The E3 ubiquitin ligase TRIM31 attenuates NLRP3 inflammasome activation by promoting proteasomal degradation of NLRP3 [J].Nat Commun, 2016, 7: 13727. doi: 10.1038/ncomms13727
[11] Py B F, Kim M S, Vakifahmetoglunorberg H, et al.Deubiquitination of NLRP3 by BRCC3 critically regulates inflammasome activity [J].Mol Cell, 2013, 49(2): 331-338. doi: 10.1016/j.molcel.2012.11.009
[12] Lopez-Castejon G, Luheshi N M, Compan V, et al.Deubiquitinases regulate the activity of caspase-1 and interleukin-1β secretion via assembly of the inflammasome [J].J Biol Chem, 2013, 288(4): 2721-2733. doi: 10.1074/jbc.M112.422238
[13] Gross O, Poeck H, Bscheider M, et al.Syk kinase signalling couples to the Nlrp3 inflammasome for anti-fungal host defence [J].Nature, 2009, 459(7245): 433-436. doi: 10.1038/nature07965
[14] Munozplanillo R, Kuffa P, Martinezcolon G, et al.K+ efflux is the common trigger of NLRP3 inflammasome activation by bacterial toxins and particulate matter [J].Immunity, 2013, 38(6): 1142-1153. doi: 10.1016/j.immuni.2013.05.016
[15] Pétrilli V, Papin S, Dostert C, et al.Activation of the NALP3 inflammasome is triggered by low intracellular potassium concentration [J].Cell Death Differ, 2007, 14(9): 1583-1589. doi: 10.1038/sj.cdd.4402195
[16] Chu J, Thomas L M, Watkins S C, et al.Cholesterol-dependent cytolysins induce rapid release of mature IL-1β from murine macrophages in a NLRP3 inflammasome and cathepsin B-dependent manner [J].J Leukoc Biol, 2009, 86(5): 1227-1238. doi: 10.1189/jlb.0309164
[17] Lee G S, Subramanian N, Kim A I, et al.The calcium-sensing receptor regulates the NLRP3 inflammasome through Ca2+ and cAMP [J].Nature, 2012, 492(7427): 123-127. doi: 10.1038/nature11588
[18] Rossol M, Pierer M, Raulien N, et al.Extracellular Ca2+ is a danger signal activating the NLRP3 inflammasome through G protein-coupled calcium sensing receptors [J].Nat Commun, 2011, 3: 1329. http://cn.bing.com/academic/profile?id=ea1c0eb3a9125342c7eb85d8d42e179c&encoded=0&v=paper_preview&mkt=zh-cn
[19] Katsnelson M A, Rucker L G, Russo H M, et al.K+ efflux agonists induce NLRP3 inflammasome activation independently of Ca2+ signaling [J].J Immunol, 2015, 194(8): 3937-3952. doi: 10.4049/jimmunol.1402658
[20] Lawlor K E, Vince J E.Ambiguities in NLRP3 inflammasome regulation: is there a role for mitochondria? [J].Biochim Biophys Acta, 2014, 1840(4): 1433-1440. doi: 10.1016/j.bbagen.2013.08.014
[21] Elliott E I, Sutterwala F S.Initiation and perpetuation of NLRP3 inflammasome activation and assembly [J].Immunol Rev, 2015, 265(1): 35. doi: 10.1111/imr.12286
[22] Van B R, Köker M Y, Jansen M, et al.Human NLRP3 inflammasome activation is Nox1-4 independent [J].Blood, 2010, 115(26): 5398-5400. doi: 10.1182/blood-2009-10-250803
[23] Liu Z, Sun M, Wang Y, et al.Silymarin attenuated paraquat-induced cytotoxicity in macrophage by regulating Trx/TXNIP complex, inhibiting NLRP3 inflammasome activation and apoptosis [J].Toxicol in Vitro, 2017: 265-272.
[24] Zhou R, Yazdi A S, Menu P, et al.A role for mitochondria in NLRP3 inflammasome activation [J].Nature, 2011, 469(7329): 221-225. doi: 10.1038/nature09663
[25] Iyer S S, He Q, Janczy J R, et al.Mitochondrial cardiolipin is required for Nlrp3 inflammasome activation [J].Immunity, 2013, 39(2): 311-323. doi: 10.1016/j.immuni.2013.08.001
[26] Subramanian N, Natarajan K, Clatworthy M R, et al.The adaptor MAVS promotes NLRP3 mitochondrial localization and inflammasome activation [J].Cell, 2013, 153(2): 348-361. doi: 10.1016/j.cell.2013.02.054
[27] Ermler M E, Traylor Z, Patel K, et al.Rift Valley fever virus infection induces activation of the NLRP3 inflammasome [J].Virology, 2014, 449: 174-180. doi: 10.1016/j.virol.2013.11.015
[28] Catherine D, Greta G, Romero J F, et al.Malarial hemozoin is a Nalp3 inflammasome activating danger signal [J].PLoS One, 2009, 4(8): e6510. doi: 10.1371/journal.pone.0006510
[29] Orlowski G M, Colbert J D, Sharma S, et al.Multiple cathepsins promote pro-IL-1 beta synthesis and NLRP3-mediated IL-1 beta activation [J].J Immunol, 2015, 195(4): 1685-1697. doi: 10.4049/jimmunol.1500509
[30] Tschopp J, Schroder K.NLRP3 inflammasome activation: the convergence of multiple signalling pathways on ROS production? [J].Nat Rev Immunol, 2010, 10(3): 210-215. doi: 10.1038/nri2725
[31] He Y, Zeng M Y, Yang D, et al.NEK7 is an essential mediator of NLRP3 activation downstream of potassium efflux [J].Nature, 2016, 530(7590): 354-357. http://cn.bing.com/academic/profile?id=132d7bfc6b0d329ffdf07e77125d7f29&encoded=0&v=paper_preview&mkt=zh-cn
[32] Shi H, Ying W, Li X, et al.NLRP3 activation and mitosis are mutually exclusive events coordinated by NEK7, a new inflammasome component [J].Nat Immunol, 2016, 17(3): 250-258. doi: 10.1038/ni.3333
[33] Schmidburgk J L, Chauhan D, Schmidt T, et al.A genome-wide CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) screen identifies NEK7 as an essential component of NLRP3 inflammasome activation [J].J Biol Chem, 2016, 291(1): 103-109. doi: 10.1074/jbc.C115.700492
[34] Lu B, Nakamura T, Inouye K, et al.Novel role of PKR in inflammasome activation and HMGB1 release [J].Nature, 2012, 488(7413): 670-674. doi: 10.1038/nature11290
[35] He Y, Franchi L, Nunez G.The protein kinase PKR is critical for LPS-induced iNOS production but dispensable for inflammasome activation in macrophages [J].Eur J Immunol, 2013, 43(5): 1147-1152. doi: 10.1002/eji.201243187
[36] Shenoy A R, Wellington D A, Kumar P, et al.GBP5 promotes NLRP3 inflammasome assembly and immunity in mammals [J].Science, 2012, 336(6080): 481-485. doi: 10.1126/science.1217141
[37] Meunier E, Dick M S, Dreier R F, et al.Caspase-11 activation requires lysis of pathogen-containing vacuoles by IFN-induced GTPases [J].Nature, 2014, 509(7500): 366-370. doi: 10.1038/nature13157
[38] Salem H, Rachmin I, Yissachar N, et al.Nek7 kinase targeting leads to early mortality, cytokinesis disturbance and polyploidy [J].Oncogene, 2010, 29(28): 4046-4057. doi: 10.1038/onc.2010.162
[39] Liu H J, Pan X X, Liu B Q, et al.Grape seed-derived procyanidins alleviate gout pain via NLRP3 inflammasome suppression [J].J Neuroinflammation, 2017, 14(1): 74. doi: 10.1186/s12974-017-0849-y
[40] Paramel Varghese G, Folkersen L, Strawbridge R J, et al.NLRP3 inflammasome expression and activation in human atherosclerosis [J].J Am Heart Assoc, 2016, 5(5): e003031. doi: 10.1161/JAHA.115.003031
[41] Lazaridis L D, Pistiki A, Giamarellos-Bourboulis E J, et al.Activation of NLRP3 inflammasome in inflammatory bowel disease: differences between crohn's disease and ulcerative colitis [J].Dig Dis Sci, 2017, 62(9): 2348-2356. doi: 10.1007/s10620-017-4609-8
[42] Olsen I, Singhrao S K.Inflammasome involvement in Alzheimer's disease [J].J Alzheimers Dis, 2016, 54(1): 45-53. doi: 10.3233/JAD-160197
[43] Youm Y H, Nguyen K Y, Grant R W, et al.The ketone metabolite β-hydroxybutyrate blocks NLRP3 inflammasome-mediated inflammatory disease [J].Nat Med, 2015, 21(3): 263-269. doi: 10.1038/nm.3804
[44] Coll R C, Robertson A A, Chae J J, et al.A small-molecule inhibitor of the NLRP3 inflammasome for the treatment of inflammatory diseases [J].Nat Med, 2015, 21(3): 248-255. doi: 10.1038/nm.3806
-
期刊类型引用(31)
1. 程永芳，林珍梅，张玲，邢楠楠. NLRP3炎症小体在代谢性疾病中的研究进展. 中国免疫学杂志. 2024(02): 445-450 . 
百度学术
2. 史梦雅，刘保岩，贺今. NLRP3炎症小体通路在矽肺纤维化中的作用及其作为治疗靶点的展望. 中华劳动卫生职业病杂志. 2024(02): 145-151 . 百度学术
3. 于长祥，钟雨虹，邢斌，贾欣陶，张瀛，张青青，刘志东. 三七总皂苷及其制剂治疗糖尿病视网膜病变的研究进展. 天津中医药大学学报. 2024(04): 348-355 . 百度学术
4. 朱智恒，赵红霞，刘叶倩，陈蕾，黄铃格，李弘，马丹凤，陈春茗，曾水清，任卫琼. 钩藤降压解郁方对高血压并发抑郁症大鼠海马突触超微结构及TLR4、NF-κB p65和NLRP3蛋白表达的影响. 中医药导报. 2024(08): 40-46 . 百度学术
5. 徐芳，唐媛媛，朱寒寒，曲梅花. ASC斑点在炎症扩散中的作用. 生命的化学. 2024(08): 1425-1432 . 百度学术
6. 马天星，李金田，李娟，张毅，梁建庆，陈世玉，张悦，姜佳辰，徐韦玮. 归芪益元膏通过NLRP3/ASC/caspase-1通路调控~(12)C~(6+)束辐射肺肾旁效应损伤大鼠的机制. 中华中医药杂志. 2024(10): 5162-5168 . 百度学术
7. 马新月，徐慧，刁佳雯，金爱花，全吉淑. 草苁蓉多糖对THP-1巨噬细胞炎症反应的抑制作用及其机制. 吉林大学学报(医学版). 2024(06): 1499-1511 . 百度学术
8. 张楠，许二平，陈玉龙. NLRP3炎症小体与抑郁症的关系及中医药的干预作用. 中国实验方剂学杂志. 2023(03): 186-193 . 百度学术
9. 胡景昱，吴昊，刘利军. 核苷酸结合寡聚化结构域样受体热蛋白结构域相关蛋白3与牙髓炎的关系及作用机制研究进展. 现代医学与健康研究电子杂志. 2023(17): 26-29 . 百度学术
10. 刘溪源，喻京生. 祛风明目丸对实验性自身免疫性葡萄膜炎大鼠NLRP3、ASC、IL-1β表达的影响. 湖南中医药大学学报. 2023(10): 1779-1785 . 百度学术
11. 刘汝薇，孟庆勇，戴蕴平，张雅丽. 人源溶菌酶结构与功能的研究进展. 生物工程学报. 2023(11): 4482-4496 . 百度学术
12. 董苗苗，赖涵，李曼玲，许秀洪，罗梦，王文豪，周国平. 电针干预脑缺血再灌注损伤模型大鼠核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3/半胱天冬氨酸蛋白酶1表达的变化. 中国组织工程研究. 2022(05): 781-787 . 百度学术
13. 颜诗怡，陈诗垚，关飞，雷家慧. ATP-P2X7R轴在炎症性疾病中的作用. 热带病与寄生虫学. 2022(01): 50-56+60 . 百度学术
14. 林桦，骆宁，秦超，于泳浩. 中医药调控NLRP3炎性小体治疗脓毒症的研究进展. 国际医药卫生导报. 2022(01): 28-32 . 百度学术
15. 殷娜，宋娜丽，普晓佳，顾茜兰，杨海浩，万春平，祁燕，李小丝，郑喜. 民族药马利筋内生真菌生物活性研究. 广西植物. 2022(05): 781-789 . 百度学术
16. 姜黎黎，单铁英，李伟，刘晓霞，宋永红，何红梅. 血管紧张素Ⅱ激活NLRP3炎性小体通路促进子宫内膜上皮细胞的转分化作用. 职业与健康. 2022(16): 2194-2197 . 百度学术
17. 梁国强，倪道磊，周岚，任燕，宋永亮，金伟民，蒋春波. 基于线粒体自噬途径探讨黄芪甲苷对阿霉素肾病大鼠的肾保护作用. 中华中医药学刊. 2022(09): 35-39+264-265 . 百度学术
18. 倪红飞，李顾楠，张伟兴，李紫燕. 结直肠癌细胞来源的外泌体miR-34a对M2型巨噬细胞极化的影响. 中国免疫学杂志. 2022(24): 2976-2979 . 百度学术
19. 唐琼，张振玲. NLRP3炎症小体在肺纤维化中作用的研究进展. 中国职业医学. 2021(05): 577-581 . 百度学术
20. 聂窈，孙宇婷，徐焕华，王宇光，高月，马增春. 阿魏酸抑制NLRP3炎症小体减轻辐射诱导的AHH-1细胞炎症. 中药药理与临床. 2020(01): 63-68 . 百度学术
21. 姜德友，李文昊，解颖，任鹏鹏，韩洁茹. 嘌呤配体P2X门控离子通道型受体7及其下游分子在痛风性关节炎中作用机制的研究进展. 世界中医药. 2020(08): 1221-1224 . 百度学术
22. 宋楠楠，杜忠君，贾强，陈尚雅，朱文文，杨旭，侯珊珊，邵华. 姜黄素抑制游离二氧化硅诱导小鼠肺泡巨噬细胞NLRP3炎性小体活化机制. 中国职业医学. 2020(02): 121-128 . 百度学术
23. 李江，颜延凤. 定喘汤对哮喘模型小鼠肺组织炎性因子及NLRP3炎症小体的影响. 光明中医. 2020(13): 1992-1995 . 百度学术
24. 冯明辉，贺松其，黄松泽，林佳鑫，杨惠琳，王嘉吉，庞杰. 鳖甲煎丸对二乙基亚硝胺诱导的大鼠肝癌的抑制作用及机制. 南方医科大学学报. 2020(08): 1148-1154 . 百度学术
25. 王文盛，刘郁，吕荣祥. NLRP3炎性小体在Th17过度分化的皮肌炎中的作用机制. 中国卫生检验杂志. 2020(15): 1879-1882+1885 . 百度学术
26. 舒广文，阿尔斯拉·玉苏甫，邱韵涵，戴晨曦，邓旭坤. 维吾尔药复方待比地力对顺铂所致小鼠肾损伤的保护作用. 中南民族大学学报(自然科学版). 2020(05): 478-482 . 百度学术
27. 王燚，杨馨，刘华辉，周海燕，杨慎峭，马文彬，肖芳，黄欣悦，席东来. 基于NLRP3炎症小体的艾灸对实验性RA家兔血清MMPs影响的研究. 时珍国医国药. 2020(10): 2553-2556 . 百度学术
28. 贺今，刘光峰，李建业，崔萍. NLRP3炎症小体在尘肺病肺纤维化中作用. 中国职业医学. 2019(01): 126-128+132 . 百度学术
29. 朱四民，王会芳，林凤平，陈冠亚，田晓玲，叶茂，孙家忠. 葛根提取物通过调控NOD样受体蛋白3/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1通路减轻糖尿病大鼠肾损伤的研究. 中国糖尿病杂志. 2019(11): 852-857 . 百度学术
30. 黄雪君，李钰婷，蔡大可，陈玉兴，甘海宁，黄丹娥，李茹月. 穿心莲酸对胆固醇结晶诱导的THP-1源性巨噬细胞损伤的影响. 广东药科大学学报. 2018(06): 754-758 . 百度学术
31. 宋占帅，邵华，陈艳芹，张蓉. NLRP3在矽肺肺纤维化发生发展中的作用及MCC950应用研究. 中国职业医学. 2018(06): 691-696 . 百度学术
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